Pembuatan semen beku

Pemeriksaan semen segar
Setelah semen ditampung secepatnya di bawa ke laboratorium untuk diperiksa kualitas maupun kuantitasnya. Setiap semen yang diperiksa  harus dicatat pada buku pemeriksaan dan ditentukan apakah semen tersebut dapat memenuhi syarat atau tidak untuk diproses menjadi semen beku. Pemeriksaan yang dilakukan adalah secara makroskopis dan mikroskopis. Standar gerakanmassayang dapat diproses adalah 2+ ke atas (skala 0-3+).
Konsentrasi sperma dihitung dengan menggunakan alat spektrofotometer.
2.         Penyiapan Bahan Pengencer
Bahan pengencer disiapkan sehari sebelum digunakan diantaranya  pengencer sitrat, air kelapa, tris, dll. Setiap bahan pengencer harus         
mampu melindungi sperma pada saat pendinginan dan selama glyserolisasi serta mampu mempertahankan  daya hidup sperma.
Syarat bahan pengencer :

1. Murah, sederhana dan praktis dibuat
2. Harus mengandung unsur-unsur yang hampir sama sifat fisik dan kimiawinya dengan semen dan tidak boleh mengandung zat toksik atau zat racun baik terhadap sperma maupun alat reproduksi betina.

Sedangkan fungsinya adalah :
1.         Menyediakan zat makanan sebagai sumber energi bagi permatozoa;
2.         Melindungi sperma terhadap cold shock;
3.         Menyediakan suatu penyanggah untuk mencegah perubahan pH;
4.         Mempertahankan tekanan osmotik dan keseimbangan elektrolit yang sesuai;
5.         Mencegah pertumbuhan kuman;
6          Memperbanyak volume semen.
Di BIB Tuah Sakato sampai dengan saat ini masih menggunakan egg yolk tris (kuning telur).
Cara membuat bahan pengencer :
v  Lakukan desinfeksi pada tempat/meja dan jari-jari tangan dengan menggunakan alcohol 70%.
v  Gunakan peralatan yang telah disterilisasi.
v  Persiapan pada bahanbaku:

1. Cek bahan-bahan yang  akan digunakan dan letakkan diatas meja.  Jangan letakkan bahan-bahan yang tidak akan diapakai diatas meja.
2. Timbang bahan-bahan dengan tepat.
3. Jangan lakukan penimbangan bahan-bahan sekaligus.
4. Lakukan pencampuran dengan cepat, pencampuran yang lambat  dapat dapat menimbulkan reaksi kimia  yang tidak diinginkan.

v  Persiapan telur

1. Telur tidak dapat disterilisasi.
2. Gunakan telur yang masih segar
3. Cuci telur lalu lakukan desinfeksi dengan menggunakan alcohol 70%
4. Telur disimpan sebentar dalam lemari es dapat  mepermudah pemisahan kuning telur dan putih telur.
5. Masukkan kuning telur ke dalam larutan yang sudah dipanaskan pada saat larutan bersuhu kurang dari 40ºC.

v  Penyimpanan

1. Volume larutan yang besar memerlukan antibiotic yang lebih banyak.
2. Pindahkan larutan ke dalam tabung ukur.
3. Simpan larutan didalam lemari es  pada suhu 4-5 ºC, tutup tabung dengan alumunium foil.
4. Larutan yang sudah disimpan didalam lemari es selama sehari akan memebentuk endapan (sendimen).
5. Supernatan yang dihasilkan, digunakan sebagai larutan pengencer A.
6. Endapan yang dihasilkan dari larutan yang disimpan semala 3 hari akan menjadi lebih padat sehingga supernatant akan lebih mudah diambil.
7. Supernatan yang sudah diambil (larutan pengencer A) dapat disimpan selama 2 minggu di dalam lemari es.

v  Pembuatan pengencer B

1. Pengencer B adalah pengencer A yang sudah ditambah dengan 13% gliserin.
2. Buat pengencer B sehari sebelum digunakan (agar gliserin benar-benar terlarut dalam larutan A).
3. Beri tanda masing-masing tabung berisi pengencer A dan B.

Prosedur Pengencer Semen
Penambahan larutan pengencer

• Perhitungan jumlah spermatozoa motil setelah thawing

1. Hitung data menggunakan computer
2. Hitung persentase spermatozoa motil setelah thawing minimaql 40%
3. Jumlah spermatozoa motil minimal 12.000.000 (1 straw berisi 30.000.000).

• Perhitungan volume total

V.total (ml) =     vol.semen (ml) x konsentrasi spermatozoa (jt/ml)
                                Konsentrasi spermatozoa pada 1 ml (cc)

• Perhitungan jumlah pengencer

Jumlah pengenceran =                               v. total (ml)
                                               v. total semen yang diperoleh (ml)

• Perhitungan volume larutan  pengencer A2 yang ditambahkan

V. Larutan pengencer =V.total (ml)- Σ V.semen(ml)+V.lar A1 (ml))
 A2 yang ditambahkan          2

• Perhtiungan volume larutan pengencer B yang ditambahkan

V.larutan pengencer B yang ditambahkan (ml)  =  V.total (ml)
                                                                                              2

• Perhitungan dosis atau jumlah straw yang digunakan

               Dosis  = V.total (ml)
                                    0,25
Contoh Perhitungan:

1. 1.      Volume total

Penampungan ke -	Volume Semen (ml)	Konsentrasi Spermatozoa ml)	Total konsentrasi spermatozoa
1. 2. Total	6.0 4.0 10.0	1.200.000.000 1.000.000.000	7.200.000.000 4.000.000.000 11.200.000.000

     Volume total  =               11.200.000.000        =     93.33 ml
                                         30.000.000 x1/0.25
2.   Jumlah pengenceran
      Jumlah Pengencaran  =      93 ml    =   9.3  kali
                                                      10 ml
3.   Volume larutan pengencer A2 yang ditambahkan
      Lart. Pengencer A2 yang ditambahkan) =
      93 ml -  {(6 ml semen + 6 ml lar. A1) + (4 ml + 4 ml lar A1)}  =  26.5
        2

1. 4.      Volume pengencer B yang ditambahkan  =  93 ml  =  46.5 ml

                                                                                  2

1. 5.      Banyaknya dosis yang akan digunakan

      Dosis  = 93 ml   =  372 dosis
                      0.25
Penambahan Pengencer A2 pada Semen

1. Penambahan Pengencer A2

-      Penambahan pengencer A2 sesuai dengan perhitungan yang sudah dilakukan
-      Persiapan alat dan bahan :

1. Yang bias digunakan berulang-ulang  : tabung ukur, gelas ukur, handuk.
2. Alat yang sekali pakai : labu elemeyer, glass filter]
3. Bahan :  larutan pengencer A

-      Saat penambahan pengencer A2 suhu larutan semen A1 harus 4-5 ºC (suhu larutan yang tinggi dapat menebabkan temperature shock pada spermatozoa)

2. Penyaringan semen

• 50 menit kemudian dilakukan pencampuran dengan Part A Extra yang telah disiapkan dalam cool top;
• Setelah itu pencampuran dengan Part B dilakukan 4 kali (proses gliserolisasi) dengan interval 15 menit;
• Kurang lebih 2 ½  jam setelah pencampuran dengan Part B terakhir (5 jam setelah pencampuran dengan Part A primer), baru dilakukan rposes pengisian semen ke dalam straw yang telah disiapkan sebelumnya.

3.         Printing Straw                     
            Printing straw dilaksanakan bersamaan dengan waktu pengenceran setelah diketahui berapa jumlah straw yang akan dicetak. Straw yang akan diprinting atau dicetak diberi keterangan tentang jenis penjantan, nama penjantan, kode penjantan, batch number dan produsen semen beku tersebut (BIB Tuah Sakato). Jumlahnya tergantung dari banyaknya spermatozoa dalam ejakulasi.
Pengecekan bangsa pejantan dengan warna straw :

• Holstein           :           Abu-abu
• Limosin           :           Pink
• Simental          :           Putih tansparan
• Brahman          :           Biru tua
• Ongole            :           Biru muda
• Angus              :          Orange
• Brangus           :           hijau tua
• Bali                  :           merah
• Madura            :           hijau muda

Melaksanakan printing straw :

1. Memasukan tinta ke dalam bak tinta pada mesin printing dan mengatur tebal tipisnya warna tinta yang disesuaikan dengan warna straw sehingga kontras (hitam atau putih);
2. Memasang kabel fiting ke stop kontak;
3. Menempelkan bull stamp (jenis, nama, kode pejantan, batch number dan BIB Tauh Sakato) pada roll besar dan mengatur jarak;
4. Memasukkan straw yang akan diprinting pada tempat straw;
5. Menjalankan mesin, mencoba dua atau tiga kali/straw untuk diprinting kemudian setelah straw tercetak bagus, mesin dimatikan dengan menekan saklar ke off;
6. Mengatur counter straw sesuai dengan jumlah straw yang dibutuhkan;
7. Menjalankan mesin dengan menghidupkan saklar ke on, mesin akan mati sendiri jika jumlah straw telah memenuhi sesuai dengan angka dalam counter;
8. Straw yang telah diprintingdi masukkan ke dalam kotak plastic dan disimpan di dalam coll top supaya dingin dan disiapkan untuk proses pengisian/filling.

 4.        Filling & Sealing
            Filling & Sealing adalah proses pengisian semen yang telah    diencerkan ke dalam straw dengan menggunakan alat yang bekerja secara otomatis (mesin filling & sealing). Mesin tersebut secara otomatis memasukkan semen cair sebanyak 0,25 cc ke dalam straw dan menutup ujung straw dengan sumbat lab. Proses ini dilakukan di dalam cool top.
Melaksanakan Filling & sealing

1. Memasang jarum penghisap, jarum pengisi dan corong tempat semen (taper dish for semen) pada tempatnya;
2. Memasang straw yang telah diprinting sesuai dengan kode pejantan yang akan diproses;
3. Menjalankan mesin dan mengatur straw yang akan diisi;
4. Mengatur jarum supaya masuk ke dalam straw;
5. Memasukkan semen ke dalam corong semen yang tersedia;
6. Merubah handle posisi engage sehingga jarum penghisap dan pengisi tepat pada posisi 3 buah straw (jangan merubah handle sewaktu mesin masih berjalan);
7. Jalankan vacuum penghisap dengan menekan saklar dari off ke on, sehingga terdengar mesin berbunyi “tit”;
8. Mesin filling & sealing dijalankan;
9.  Mengawasi straw yang sedang diisi, bila jepitnya kurang baik atau terisi, matikan mesin dengan menekan saklar dari on ke off;
10. Setiap mesin berhenti harus selalu pada posisi sedang menutup/menjepit straw.

5.         Freezing / Pembekuan Semen
Setelah dilaksanakan filling sealing, straw yang berisi semen cair disusun di atas rak dan dihitung jumlahnya, kemudian dibekukan. Proses pembekuan dilakukan di atas permukaan N2 Cair di dalam storage container dengan suhu -110 sampai dengan -120 ⁰C selama 9 menit. Suhu tersebut diperoleh bila straw yang disusun di atas rak ditempatkan kurang lebih 4 cm di atas permukaan N2 cair.  Jumlah maksimum straw yang dapat dibekukan dalam satu kali pembekuan (9 menit) adalah 550 straw.  Setelah dibekukan semen beku disimpan di dalam storage container yang berisi N2 cair.  Jumlah yang didapat dan tempat penyimpanan dicatat di dalam buku pejantan